Extracto

Nuestro estudio anterior encontró que [6] -shogaol, un componente bioactivo importante en el jengibre, se metaboliza ampliamente en las células cancerosas y en ratones. No está claro si estos metabolitos mantienen la bioactividad. El objetivo del presente estudio es sintetizar los principales metabolitos de [6] -shogaol y evaluar su inhibición del crecimiento y la inducción de la apoptosis en células de cáncer humano. Doce de metabolitos [6] -shogaol (M1, M2 y M4-M13) fueron sintetizados con éxito utilizando métodos químicos sencillos y fácilmente accesibles. ensayos de inhibición de crecimiento mostraron que la mayoría de los metabolitos de [6] -shogaol tenía actividades mensurables contra las células de cáncer humano HCT-116 y H-1299. En particular, metabolito M2 retenido en gran medida las actividades biológicas de [6] -shogaol, con una CI
50 de 24,43 M en 116 HCT-células de cáncer de colon humano y un IC
50 de 25,82 micras de H-1299 humana células de cáncer de pulmón. También exhibe una potencia relativamente alta fue tiol-M13 conjugado, con IC
50 valores de 45,47 y 47,77 M hacia las células HCT-116 y H-1299, respectivamente. La evaluación de la toxicidad de los metabolitos sintéticos (M1, M2, y M4-M13) contra células de fibroblastos normales de colon humano células pulmonares normales humanos IMR-90 CCD-18Co y demostró una biotransformación metabólica desintoxicación de [6] -shogaol. El metabolito más activo M2 tenía casi ninguna toxicidad para CCD-18Co y IMR-90 células normales con IC
50 años de 99,18 y 98,30 M, respectivamente. TUNEL (Terminal fin de etiquetado desoxinucleotidil transferasa dUTP nick) de ensayo indica que la apoptosis fue provocada por metabolitos M2, M13, y sus dos diastereómeros M13-1 y M13-2. No hubo diferencia significativa entre el efecto apoptótico de [6] -shogaol y el efecto de M2 ​​y M13 después de tratamiento 6 horas

Visto:. Zhu Y, Warin RF, Soroka DN, Chen H, Sang S ( 2013) Los metabolitos de jengibre Componente [6] -shogaol Remain bioactivos en las células cancerosas y tienen baja toxicidad en células normales: Síntesis química y Evaluación Biológica. PLoS ONE 8 (1): e54677. doi: 10.1371 /journal.pone.0054677

Editor: José J. Barchi, Instituto Nacional del Cáncer en Frederick, Estados Unidos de América

Recibido: 24 Octubre, 2012; Aceptado: 13 de diciembre de 2012; Publicado: 30 Enero 2013

Derechos de Autor © 2013 Zhu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones CA138277 y CA138277S1 a SS. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

a pesar de los enormes esfuerzos realizados hacia el desarrollo de terapias contra el cáncer durante las últimas décadas, el cáncer sigue siendo un problema importante de salud pública en todo el mundo. aumento de la evidencia ha mostrado que los tratamientos con agentes o inhibidores que se dirigen a un único evento biológico o una sola vía específica suele fallar en la terapia del cáncer [1]. agentes quimioterapéuticos convencionales se han demostrado estar asociados con una toxicidad inaceptable. Se necesitan con urgencia nuevos enfoques para el control del cáncer. La quimioprevención es un área innovadora de investigación sobre el cáncer que se centra en la prevención del cáncer a través farmacológica, biológica, y las intervenciones nutricionales [2]. estudios de acumulación han demostrado que los fitoquímicos dietéticos presentes en plantas y frutas, que se consideran generalmente como agentes no tóxicos, pueden activar o bloquear múltiples vías importantes que están implicados en la supervivencia de células de cáncer y el crecimiento [1], [3], [4] . La quimioprevención por fitoquímicos comestibles ahora se considera que es un método seguro, barato, fácilmente aceptable y accesible para la prevención del cáncer, control y gestión.

El jengibre, el rizoma de
Zingiber officinale
, ha sido una comúnmente utilizado especias y droga cruda durante muchos años en todo el mundo. El jengibre es promocionado por su alivio de las náuseas, las propiedades anti-inflamatorias, y la actividad anti-cáncer putativo [5] - [7]. Los principales componentes farmacológicamente activos de jengibre son gingeroles y shogaoles (Figura 1) [5]. El tratamiento térmico de los gingeroles da shogoals como los constituyentes principales de jengibre seco [5], que muestran con frecuencia una mayor actividad anti-cancerígenos que sus precursores. Por ejemplo, nuestro grupo ha demostrado que [6] -, [8] - y [10] -shogaols mostraron mucho más alta potencia anti-proliferativa de [6] -, [8] - y [10] -gingerols contra H- 1299 pulmón humano y HCT-116 células de cáncer de colon humano [8]. Kim
et al
. informó de que [6] -shogaol mostraron un crecimiento mucho más fuerte de efectos inhibitorios en células A-549 de cáncer de pulmón, HCT-15 células humanas de cáncer de colon, 3 SK-OV-células humanas de cáncer de ovario, y 2 SKMel células de cáncer de piel humanas que [ ,,,0],4] -, [6] -, [8] -, y [10] -gingerols [9]. Junto con nuestros colaboradores, hemos encontrado que [6] -shogaol fue más eficaz que [6] gingerol en la inhibición de 12
O
-tetradecanoilforbol 13-acetato (TPA) la promoción de tumores inducida en ratones [10 ]. Un estudio más reciente encontró que [6] -shogaol apoptosis inducida, la activación de caspasa, y poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) escisión tanto en las células de carcinoma hepatocelular humano SMMC-7721 y xenoinjertos tumorales SMMC-7721 a través de un retículo endoplásmico (ER ) con el estrés asociado mecanismo [11].

Un estudio reciente de nuestro grupo ha demostrado que [6] -shogaol se metaboliza ampliamente en ratones y en células de cáncer, en el que trece metabolitos (M1-M13 ) fueron detectados e identificados [12]. cantidad traza de metabolitos M6-M12 se purificaron a partir de muestras fecales recogidas de ratones [6] -shogaol tratados, y sus estructuras se caracterizaron basa en el análisis de datos
1H,
13C, y 2-D de RMN [12 ]. Las estructuras de los metabolitos restantes (M1-M5 y M13) fueron determinadas en base al análisis de su MS
n (n = 1-3) y espectros de comparación con patrones auténticos. Con su α, la estructura de cetona β-insaturados, se encontró que [6] -shogaol se puede reducir para generar metabolitos M6-M9 y M11. También se encontró que [6] -shogaol es el sustrato para la conjugación de tiol a través de la ruta del ácido mercaptúrico para formar metabolitos M1-M5, M10, M12, y M13. Dado que la mayoría de [6] -shogaol se metaboliza
in vivo
y en las células cancerosas, la cuestión crucial es si los metabolitos de [6] -shogaol son bioactivos. Incluso si es menos potente que [6] -shogaol, aún pueden contribuir a la actividad biológica global de [6] -shogaol
in vivo
.

El desafío actual para el estudio de la bioactividad de los metabolitos es su falta de disponibilidad comercial. Con trazas de metabolitos purificados a partir de las muestras de heces de ratón, sólo hemos podido investigar los efectos de los dos principales metabolitos M9 y M11 en la inhibición del crecimiento y la inducción de la apoptosis en células de cáncer humano. Nuestros resultados mostraron que M9 y M11 son compuestos bioactivos que pueden inhibir el crecimiento de células cancerosas y inducir apoptosis en células de pulmón y cáncer de colon humano, aunque con menor potencia que [6] -shogaol. Por lo tanto, es oportuno desarrollar métodos químicos para sintetizar los metabolitos de [6] -shogaol y examinar aún más sus actividades contra el cáncer. El presente estudio describe una síntesis química de los metabolitos anteriormente identificados de [6] análisis -shogaol y una bioactividad en las células cancerosas. También investigaron son las toxicidades de [6] -shogaol y sus metabolitos en las células del pulmón y de colon humanos normales, que proporciona una comparación de [6] la toxicidad de -shogaol en un modelo no-cáncer.

Resultados

Síntesis química de los metabolitos de [6] -shogaol

Doce metabolitos (M1, M2 y M4-M13) fueron sintetizados con éxito de [6] -shogaol utilizando enfoques semisintéticos simples y de fácil acceso en la actual de estudio (Figuras 2 y 3). En resumen, la reacción de [6] -shogaol con L-cisteína (Cys), N-acetil-L-cisteína (NAC) o L-glutatión (GSH), generado tiol conjugados M2, M5 o M13, respectivamente (Figura 2). Posteriormente, la reducción de tiol-conjugados M2 o M5 por NaBH
4 condujo a conjugados hidroxilados M1 o M4, respectivamente (Figura 2). La reducción selectiva de [6] -shogaol por una combinación de NaBH
4 y CeCl
3.7H
2O resultó en M6 (Figura 3) [13]. La hidrogenación de [6] -shogaol sobre Pd /C dio M11, seguido de tratamiento con NaBH
4 para producir M9 (Figura 3). Además, la desmetilación de M11 utilizando BBr
3 dio M8 (Figura 3). reacción de Michael de [6] -shogaol con NaOMe o NaSMe produce el aducto metoxi M7 o el aducto metiltio M10, respectivamente (Figura 3) [14], [15]. De los cuales, el aducto metiltio M10 se trató con NaBH
4 para dar M12 (Figura 3). Dado que tanto la reducción de la cetona y las reacciones de Michael usadas en este estudio son no estereoselectiva, metabolitos M1, M2, M4-M7, M9, M10, M12, M13 y se sintetizan como mezclas de diastereómeros.

Reactivos y condiciones: i.) L-cisteína, NaHCO3 (cat), MeOH /H2O, rt, 24 h; ii) NaBH4, MeOH, 0 ° C, 2 h; iii) N-acetil-L-cisteína, NaHCO3 (cat), MeOH /H2O, rt, 72 h.; . Iv) L-glutatión reducido, NaHCO3 (cat), MeOH /H2O, rt, 3 h

Reactivos y condiciones: i.) H2, Pd /C (10% w /w), THF, rt, 18 h; ii) BBr3, DCM, -78 ° C rt, 2 h; iii) NaBH4, MeOH, 0 ° C rt, 2 h; iv) aq. 15% NaSCH3, THF, rt, 6 h; v) Na, MeOH, 0 ° C -rt, 4 h; vi) NaBH4, CeCl3.7H2O, MeOH, 78 ° C, 30 min.

Nos han caracterizado completamente las estructuras de M5-M12 usando su RMN 1-D y 2-D y de espectro de masas datos de nuestro estudio anterior [12]. Por lo tanto, las estructuras de estos compuestos sintéticos se confirmaron por comparación de su
1H y
13C espectros de RMN con los de patrones auténticos obtenidos a partir de muestras de heces de ratón. Las estructuras de los metabolitos sintéticas restantes (M1, M2, M4, y M13), previamente deducidas por las técnicas de espectrometría de masas de múltiples etapas [12], se confirmaron además por sus datos de los espectros 1-D y 2-D de RMN para la primera vez.

M2 mostró la fórmula molecular C
20H
31NO
5S sobre la base de positivo APCI-MS en
m /z
398 [m + H]
+ y sus datos
1 H y
13C RMN. El peso molecular de M2 ​​fue de 42 unidades de masa menos que la de la N-acetilcisteína conjugado [6] -shogaol (M5) [12] que indica M2 fue la cisteína conjugada [6] -shogaol. Esto estaba de acuerdo con el hecho de que M2 fue hecha por [6] -shogaol y L-cisteína. Esto también fue apoyada por la observación de la ausencia de un grupo acetilo en el
1 H y
espectros de RMN 13C de M2. La unión de un resto L-cisteinil al [6] -shogaol residuos en el C-5 fue establecido por HMBC picos cruzados entre H
Cys-β (δ
H 3,18 y 2,84) y C-5 ( δ
C 42,3) (Figura 1). Por lo tanto, M2 se confirmó que era 5-cysteinyl- [6] -shogaol
.
M1 tenía la fórmula molecular de C
20H
33NO
5S sobre la base de positivo APCI-MS a
m /z
400 [m + H]
+ y su
1 H y
13C datos de RMN. El peso molecular de M1 fue de 2 unidades de masa mayor que la de M2, la combinación con el hecho de que M1 era un producto reducido cetona de M2, y también apoyado por la aparición de metinos oxigenados (dos conjuntos de protones para los diastereómeros en δ
H 3,66 y δ
H 3,90; y δ
C 69.3) en su
1 H y
espectros de RMN 13C. correlaciones HMBC clave entre H-3 (δ
H 3,66 y δ
H 3,90) a C-1 (δ
C 32.5) y C-5 (δ
C 43.8), así como H-1 (δ
H 2.68 y 2.58) a C-3 (δ
C 69.3) en M1 (Figura 1), estableció un grupo hidroxilo en C-3 en la cadena lateral alquilo de M1. HMBC cruzadas picos entre H
Cys-β (δ
H 3.15 y 2.85) a C-5 (δ
C 43.8), y H-5 (δ
H 2.94) a C
Cys-β (δ
C 32.8) siempre que la vinculación del resto cisteinilo y C-5 de la posición M1 a través de un enlace tioéter. Por lo tanto, M1 se confirmó que era 5-cisteinil-M6.

M4 mostró la fórmula molecular C
22H
35NO
6S sobre la base de positivo APCI-MS en
m /z
442 [M + H]
+ y su
1 H y
Los datos de RMN 13C. El peso molecular de M4 fue de 2 unidades de masa mayor que la del M5 (5-
N
-acetylcysteinyl- [6] -shogaol), cumpliendo con el hecho de que M4 era un producto reducido cetona de M5. Esto fue apoyado además por la aparición de metinas oxigenados (dos conjuntos de protones de los diastereómeros en δ
H 3,70 y δ
H 3,88; y δ
C 69.3) en su
1 H y
13C espectros de RMN, la desaparición del grupo cetona carbonilo esperado en [6] -shogaol, y las correlaciones HMBC clave observados a H-3 (δ
H 3,70 y δ
H 3,88) a C-1 ( δ
C 32,5) y C-5 (δ
C 43.8), así como H-1 (δ
H 2,67 y 2,58) para C-3 (δ
C 69.3) en su espectro HMBC (Figura 1). El grupo acetilo se representa unido a alfa-NH
2 de la fracción cisteinil por la correlación HMBC detectado en H
Cys-α (δ
H 4.54) a CH
3CO (δ
C 174,0). Además, HMBC cruzadas picos entre H
Cys-β (δ
H 3,00 y 2,80) y C-5 (δ
C 43,8) proporcionó el enlace de un resto acetylcysteinyl y la posición C-5 de M4. M4, del mismo, se confirmó que era 5-
N
-acetylcysteinyl-M6.

M13, que tiene la fórmula molecular C
27H
41N
3O
9S sobre la base de positivo APCI-MS a
m /z
584 [m + H]
+ y sus datos de RMN, fue hecha por [6] -shogaol y la reducción de L-glutatión (GSH) .
1H-
1H COSY cruzadas picos encontrados en H
Glu-α /H
Glu-β /H
Glu-γ, en combinación con las correlaciones HMBC clave entre H
Glu-α (δ
H 3,65) para Glu α-COOH (δ
C 174.0), así como H
Glu-γ (δ
H 2,55 y 2,51) para Glu γ-cON ( δ
C 175.2), reconoció la estructura de un residuo glutamil (Glu) (Figura 1). La estructura del resto cisteinilo (Cys) fue establecido por
1H-
1H COSY cruzadas picos a H
Cys-α /H
Cys-β en combinación con la correlación entre HMBC H
Cys-β (dos conjuntos de protones a δ
H 3,05-2,95 y 2,84-2,80) para Cys α-cON (δ
C 175,2) (Figura 1). Posteriormente, se establece la conexión del residuo glutamil con el resto cisteinilo entre Glu γ-COOH y Cys α-NH
2 a través de un enlace amida, por correlaciones HMBC encontrado en H
Cys-α (δ
H 4,50) para Glu γ-cON (δ
C 175.2). Se encontró que la unión de un resto glicinil al residuo cisteinil entre Cys α-COOH y Gly α-NH
2, por correlaciones HMBC observados en H
Gly-α (δ
H 3,80) a Cys α -CON (δ
C 175.2). Por lo tanto, el residuo GSH fue, sin duda, identificado como γ-glutamil-cysteinylglycine. En consecuencia, la vinculación de la fracción de GSH a la [6] -shogaol residuo se estableció en C-5 a través de un enlace tioéter por correlaciones HMBC se encuentran en H
Cys-β (dos grupos de protones a δ
H 3.05- 2,95 y 2,84 a 2,80) a C-5 (δ
C 42.2). Por lo tanto, M13 se confirmó que era 5-glutathiol- [6] -shogaol.

Separación de isómeros M13 en HPLC preparativa dio como resultado dos diastereoisómeros, M13-1 y M13-2, que tenían muy similar
1H y
espectros de RMN 13C. Las principales diferencias fueron el
señales de 1H para H
Cys-βb (δ
H 2,73 vs 2,81 en M13-1 en M13-2) y H-4 bis (δ
H 2.76 en M13 -1 frente a 2,70 en M13-2) y el
señales 13C para C-4 (δ
C 49,9 vs 49,6 en M13-1 en M13-2) y C-5 (δ
C 42.0 vs. 42.4 en M13-1 en M13-2) (Figura 4). En sus espectros NOESY, observamos las correlaciones entre H
Cys-βb (δ
H 2.73) y H-5 (δ
H 3.10) en M13-1 y H
Cys-ßA ( δ
H 2,97) y H-5 (δ
H 3,10) en M13-2, lo que sugiere que H-5 en M13-1 tenían la misma configuración que la de H
Cys-βb y H- 5 en M13-2 tenían la misma configuración que la de H
Cys-ßA (Figura 4). Se sabe que H
Cys-α en el residuo de GSH tiene el
R
configuración (Figura 4). La constante de acoplamiento (
J
= 5,0 Hz) de H
Cys-ßA (δ
H 2.97) con H
Cys-α (δ
H 4.49) es mucho menor que (
J
= 8,7 Hz) de H
Cys-βb (δ
H 2.81) con H
Cys-α, lo que sugiere que H
Cys-ßA (δ
H 2.97) tiene el mismo
R
configuración que la H
Cys-α y H
Cys-βb tiene el
S
configuración. Por lo tanto, las configuraciones de H-5 en M13-1 y M13-2 se les asignó tentativamente como
S
y
R
, respectivamente (Figura 4).

efectos inhibidores del crecimiento contra el cáncer humano y las células normales

Dos líneas celulares de cáncer humano, HCT-116 y H-1299, se trataron con [6] -shogaol o sus metabolitos sintéticos M1, M2, y M4-M13 , con concentraciones que van de 0 a 80 mM. Ensayos de viabilidad celular utilizando MTT dio lugar a ocho metabolitos activos, M2, M5, M6, M8-M11 y M13, frente a las células de cáncer de colon HCT-116, con CI
50 valores de 24,43, 54,26, 68,77, 58,76, 82.22, 78.16, 83.97, y 45.47 mu M, respectivamente (Figura 5), ​​y ocho metabolitos activos, M2, M5, M6 y M9-M13, en células de cáncer de pulmón H-1299, con IC
50 valores de 25,82, 72,62, 61.28, 82.50, 60.63, 66.50, 69.91, 47.77 y M, respectivamente (Figura 6). Entre ellos, M2, la cisteína conjugada metabolito de [6] -shogaol, se encontró que era más potente hacia tanto las células HCT-116 y H-1299 con IC
50 valores de 24,43 y 25,82 mM, respectivamente, que fue comparable al padre [6] -shogaol, con una CI
50 de 18,20 M en las células HCT-116 y un IC
50 de 17,90 M en células H-1299. El segundo metabolito más activo fue 5-glutathionyl- [6] -shogaol (M13), con IC
50 valores de 45,47 y 47,77 M en células H-1299 HCT-116 y, respectivamente. 5-
N
-acetylcysteinyl- [6] -shogaol (M5) también mostraron una bioactividad notable con IC
50 valores de 54,26 M en las células HCT-116 y 72,62 M en células H-1299. Este metabolito, sin embargo, se muestra disminución de la actividad en comparación con la de 5-cysteinyl- [6] -shogaol (M2), lo que sugiere la acetilación en α-NH
2 de la fracción de cisteinil disminuye la actividad de M2. Por otra parte, la reducción de un grupo cetona en la cadena lateral alquilo dio lugar a poca o ninguna actividad contra las células de cáncer HCT-116 y H-1299, como se observa a partir de M1 y M4 frente a M2 y M5, así como M6, M9 y M11 frente a [6] -shogaol, lo que indica la biotransformación reductiva de [6] -shogaol y sus metabolitos fue inactivar principalmente.


Bar &, error estándar (n = 6).



Bar &, error estándar (n = 6).

Evaluación de la citotoxicidad en células de fibroblastos normales de colon humano normal de las células pulmonares humanas CCD-18Co y IMR-90 mostraron que todos los metabolitos sintéticos (M1, M2 y M4-M13) fueron menos tóxicos que los padres [6] -shogaol, y la mayoría de ellos tenían poco o ningún efecto inhibidor (Figuras 5 y 6), lo que indica una biotransformación metabólica de desintoxicación [6] -shogaol. Más importante aún, el metabolito M2, que tiene la mayor potencia contra las células cancerosas H-1299 tanto HCT-116 y, casi no mostró toxicidad hacia las células normales del colon células pulmonares normales de IMR-90 con IC CCD-18Co y
50 valores de 99,18 y 98,30 M, respectivamente, en comparación con los de los padres [6] -shogaol con una CI
50 de 43,91 M hacia la línea de células de colon normales CCD-18Co y un CI
50 de 36.65 M hacia la línea normal de pulmón de células IMR -90. Por otra parte, M13, con CI
50 valores de 75.50 y 57.54 M contra las células CCD-18Co y IMR-90, respectivamente, también muestran una menor toxicidad en comparación con los padres [6] -shogaol.

Con el fin de investigar la influencia de la estereoquímica en la actividad, metabolito M13, como una mezcla de diastereómeros, se separó por fase inversa HPLC prep en dos isómeros individuales, M13-1 y M13-2. Las células de cáncer HCT-116 y H-1299 fueron tratados con M13 o sus estereoisómeros constituyentes (M13-1 y M13-2) individualmente, con concentraciones que van de 0 a 80 mM. Hemos encontrado ambos isómeros tenían actividad similar pero ligeramente menos de M13, y M13-2 a ser ligeramente más eficaz que M13-1, con una CI
50 valor de 54,90 M en las células HCT-116 y 63,77 mM en H-1299 células, frente a 71,20 micras y 74,39 M en las mismas respectivas líneas de células (Figura 7). Reconstituida M13 por individuos M13-1 y M13-2 con una relación aproximada de 01:02 (molar /molar), que es similar a la relación en M13 original, se muestra la actividad equivalente, con IC
50 valores de 46.46 M en HCT-116 celular y 41,98 mM en células H 1299, en comparación con la M13 original con IC
50 valores de 45,47 M en las células HCT-116 y 47,77 mM en células H-1299. Esto sugiere que el efecto inhibidor del crecimiento observado de M13 no podía atribuirse a uno u otro isómero.


Bar &, error estándar (n = 6).

M2 y M13 inducir la apoptosis en células de cáncer humano

en muchos casos, la muerte celular es el resultado de la activación de la vía reguladora importante llamado apoptosis, o muerte celular programada. El objetivo fue determinar si la apoptosis se desencadenó tras la exposición a [6] -shogaol y sus metabolitos mediante el uso de un ensayo de TUNEL, que detecta el ADN se rompe característica de las células sometidas a la apoptosis. En este estudio, hemos probado los dos metabolitos más activos contra el crecimiento de células de cáncer, M2 y M13, así como uno de los metabolitos más abundantes, M6, junto con [6] -shogaol. Incubamos H-1299 y HCT-116 células con ellos a diversas concentraciones para determinar el intervalo activo de estos compuestos frente a sólo el DMSO. Los resultados se resumen en la Figura 8. Después de 24 horas de incubación, metabolito M6 no muestra ningún efecto apoptótico en líneas de células H-1299 HCT-116 y. Se observó apoptosis significativa para M2 y M13 en ambas líneas celulares, excepto por M2 en las células H-1299 para la concentración de 20 mM. La inducción de la apoptosis por [6] -shogaol fue significativamente superior a la de tanto M2 y M13 en la misma concentración (20 mM). En las células H-1299, un efecto apoptótico equivalente a [6] -shogaol se podría obtener si la concentración de M2 ​​y M13 fue el doble (40 M) que la de [6] -shogaol. Se obtuvieron resultados similares en las células HCT-116, excepto que la inducción de apoptosis M2 fue significativamente mayor en 40 mM. En todas las líneas celulares, un incremento en la concentración de [6] -shogaol, M2, M13, M13-1, M13-2 o M6 produjo un aumento correspondiente en el nivel de apoptosis en las células cancerosas (Figura 8A y 8B).

células TUNEL positivas se han observado en el encendido 400X. 10 campos por portaobjetos han sido contados y promediado.
Bar &, error estándar; O, no significativo; +, P & lt; 0,05; *, P & lt; 0,01; **: P & lt; 0,0001. Todas las pruebas estadísticas son la prueba t de Student para datos independientes, 2 de cola, en comparación con DMSO o el correspondiente [6] concentración -shogaol.

Con el fin de determinar si el efecto de apoptosis observada en la Figura 8A y 8B era constante en el tiempo, que se incubaron con [6] -shogaol, M2 y M13 en células HCT-116 por sólo 6 horas (Figura 8C). Después de 6 horas de incubación con [6] -shogaol o metabolitos M2 o M13, hemos sido capaces de detectar niveles significativamente más altos de apoptosis para todos los 3 compuestos en comparación con DMSO en las células HCT-116. Curiosamente no hubo diferencia significativa entre el efecto apoptótico de [6] -shogaol y los efectos de M2 ​​en 20 y 40 mM y M13 a 40 mM. M13 fue significativamente más potente que [6] -shogaol a 20 mM. La exposición de las células HCT-116 a M13 isómeros M13-1 y M13-2 también mostraron un mayor nivel de apoptosis, pero efecto apoptótico los isómeros 'fue significativamente inferior en comparación con [6] -shogaol para ambas concentraciones utilizadas. Estos resultados muestran que la apoptosis se desencadena por [6] metabolitos -shogaol M2, M13, M13-1 y M13-2, y es el mecanismo responsable, al menos parcialmente, por la muerte celular observada previamente.

Discusión

en la actualidad se acepta que los compuestos naturales proporcionan la oportunidad de intervenir en las primeras etapas del cáncer o prevenir su desarrollo completo [16]. Sin embargo, estos compuestos tienen sus limitaciones, como la rápida
in vivo
volumen de negocios, cantidades limitadas en los productos alimenticios, y su eventual toxicidad a dosis más altas [17]. Es notable que los efectos anti-cáncer para estos compuestos pueden ser observados en estudios de cohortes a pesar de la corta vida media y el metabolismo rápido una vez ingerida [18]. A menudo, la presencia del compuesto sólo puede evaluarse mediante la cuantificación de los metabolitos, lo que sugiere que estos metabolitos circulan en el cuerpo durante una cierta cantidad de tiempo y potencialmente interactúan con procesos biológicos [19]. En consecuencia, una hipótesis que explica la bioactividad de los compuestos naturales es que los propios metabolitos retienen y llevan a parte o la totalidad de la bioactividad del compuesto inicial. El presente estudio exploró esta posibilidad utilizando [6] -shogaol, el componente principal de jengibre seco, y sus metabolitos.

Nuestro estudio anterior ha indicado que [6] -shogaol se metaboliza extensamente en ratones y en células de cáncer y más de 90% de [6] -shogaol se convierte en sus metabolitos [12]. También notamos que celular normal humano IMR-90 en cierta medida metabolizado [6] -shogaol de una manera similar a las células de cáncer (datos no mostrados). Como resultado, rápido metabolismo de [6] -shogaol podría ofrecer la posibilidad de que sus metabolitos estables a participar en los procesos biológicos si poseyeran bioactividades. Con el fin de verificar esta hipótesis, es crítico para obtener los metabolitos en una forma estable. El aislamiento de su entorno nativo no sería conveniente y lo más probable es que no cedería las cantidades necesarias para la biología experimental. A la síntesis química es mucho más deseable, reproducible y eficiente. Hemos purificado M6-M12 en cantidades muy limitadas (0,5-17 mg) a partir de muestras fecales recogidas de [6] -shogaol ratones tratados [12]. Con el fin de tener suficiente cantidad para estudiar más a fondo la bioactividad de [6] metabolitos -shogaol, se describen los pasos que permiten la síntesis química de los metabolitos principales de [6] -shogaol en este estudio. Doce metabolitos de [6] -shogaol (M1, M2, y M4-M13) fueron sintetizados con éxito por los enfoques viables. Las estructuras de los metabolitos sintéticos fueron verificados usando 1-D y /o 2-D de datos de RMN, así como los espectros de masas.

Se compararon los efectos inhibidores del crecimiento de los metabolitos sintéticos con [6] en dos -shogaol humana las células de cáncer y dos células normales humanos. Nuestros resultados mostraron que dos metabolitos, M2 y M13, poseían el crecimiento más comparable efectos inhibidores a [6] -shogaol hacia las células cancerosas. Lo más importante, M2 exhibió un efecto discriminatorio, ya que no parecía ser tóxico hacia las células normales. Este efecto no se detectó con [6] -shogaol. M13 también mostró efectos menos tóxicos hacia las células normales en comparación con [6] -shogaol. Además, M5, M6 y M8-M12 también tenían cierta potencia contra el crecimiento de células cancerosas, pero no mostraron toxicidad hacia las células normales con IC
50 valores mayores de 100 micras (Figuras 5 y 6). Nuestros resultados indican claramente que los metabolitos de [6] -shogaol permanecen bioactivo contra las células cancerosas, pero son mucho menos tóxicos que [6] -shogaol a las células normales. Esto confirma nuestra hipótesis de que los propios metabolitos retienen y llevan a parte o la totalidad de la bioactividad del compuesto inicial.

La apoptosis es un mecanismo a menudo responsables de la inducción de la muerte celular en respuesta al estrés interno o externo. Con el fin de entender mejor el mecanismo de acción de los metabolitos, se realizó un ensayo de TUNEL en las células HCT-116 mediante M2, M6, M13 y sus dos isómeros, M13-1 y M13-2 y comparamos sus actividades a la de [ ,,,0],6] -shogaol. Se demostró que tanto M2 y M13, pero no M6, son capaces de inducir la apoptosis de células de cáncer tanto en las células de cáncer HCT-116 colon humano y células de cáncer de pulmón humano H-1299 (Figura 8A y 8B). Para M13, inducción de la apoptosis podría no firmemente atribuirse a un isómero o el otro, lo que sugiere que la configuración estéreo no es importante para la bioactividad de este compuesto. Hemos observado que tanto M2 y M13 podrían desencadenar apoposis en las células HCT-116 en un nivel similar a la de [6] -shogaol en el punto de tiempo de 6 horas (Figura 8C). Sin embargo, después de 24 horas de exposición a los metabolitos, el porcentaje de células TUNEL positivas era en su mayoría sin cambios en 20 mM para ambos M2 y M13, mientras que el efecto de [6] -shogaol se incrementó notablemente. El efecto de inducción de apoptosis en M2 a una concentración de 40 mM aumentó drásticamente en el punto de tiempo de 24 horas en comparación con la del punto de tiempo de 6 horas, que fue significativamente mayor que la de M13 a una concentración 40 mM. También se observó un efecto dependiente de la concentración de [6] -shogaol y sus metabolitos sobre la apoptosis de células de cáncer, en donde un aumento de la concentración de un compuesto resultó en un correspondiente aumento del porcentaje de células apoptóticas. En total, estos resultados sugieren que es probable que la activación de otros mecanismos están implicados en el desencadenamiento de la muerte de células de cáncer, sin embargo, la apoptosis parece ser una de las principales vías activadas para [6] metabolitos -shogaol para inducir la muerte de células de cáncer.

siempre es un reto para separar isómeros estéreo. Entre todos los metabolitos sintetizados, M13 era la mezcla de diastereoisómeros únicos que hemos sido capaces de separar usando una columna de HPLC preparativa no quiral. Nuestros resultados indican que M13 como la mezcla de M13-1 y M13-2 tenía ligeramente mejor efectos inhibidores del crecimiento sobre las células de cáncer que los dos diastereómeros solos y M13-1 y M13-2 tenían una actividad similar, aunque M13-2 era ligeramente más potente que M13-1. Más importante aún, observamos M13 como el metabolito de [6] -shogaol en forma de una mezcla de M13-1 y M13-2 en HCT-116 células de cáncer de colon humano (datos no mostrados). Sería conveniente para separar los dos diastereoisómeros de M2, el metabolito más activo de [6] -shogaol, utilizando una columna quiral y además determinar el efecto de la configuración estéreo en la actividad de este compuesto en estudio futuro. Recientemente hemos identificado como un metabolito M2 de [6] -shogoal en los seres humanos (datos no publicados). Por lo tanto, es importante para determinar si M2 existe como una mezcla de dos diastereómeros en ratones y en seres humanos
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En conclusión, el presente estudio nos permitió demostrar que los metabolitos de [6] -shogoal puede dar cuenta de la bioactividad del compuesto original, y específicamente desencadena vías moleculares responsables de la muerte de células de cáncer de una manera similar. Se sugiere que la actividad anti-cáncer atribuye a compuestos tales como [6] -shogoal podría haber sido mal representado parcialmente en el pasado. Lo que se pensó originalmente para ser un efecto del compuesto natural podría haber sido el resultado directo de un rápido metabolismo del compuesto, lo que hace que sea menos capaz de desencadenar mecanismos moleculares. Sin embargo, la aparición de sus metabolitos en los tejidos diana a continuación, complementaría, mantener o reemplazar por completo el efecto bioactivo del compuesto inicial. Suplementaria
in vivo serán necesarios
estudios para obtener una respuesta definitiva a esta pregunta, pero a partir de ahora el estudio que aquí se presenta se abre nuevas posibilidades de investigación para el estudio de los metabolitos bioactivos de [6] -shogaol.

Materiales y Métodos

Materiales

[6] -shogaol se purificó a partir de extracto de jengibre en nuestro laboratorio [8].